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　　【本生生物】細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)點(diǎn)

　　細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)中使用的最重要的工具之一，它為研究正常的生理學(xué)和生物化學(xué)提供了出色的模型系統(tǒng)(例如，代謝研究，衰老)，藥物和有毒化合物對(duì)細(xì)胞的影響以及細(xì)胞的影響 誘變和癌變。 它也用于藥物篩查和發(fā)育，以及生物化合物(例如疫苗，治療蛋白)的大規(guī)模生產(chǎn)。 將細(xì)胞培養(yǎng)用于這些應(yīng)用中的任何一種的主要優(yōu)點(diǎn)是可以通過使用一批克隆細(xì)胞獲得的結(jié)果的一致性和可重復(fù)性。

　　細(xì)胞培養(yǎng)是指從動(dòng)物或植物中去除細(xì)胞，然后在有利的人工環(huán)境中生長。細(xì)胞可以在培養(yǎng)前直接從組織中取出并通過酶或機(jī)械手段分解，或者它們可以來源于已經(jīng)建立的細(xì)胞系或細(xì)胞株

　　1.初級(jí)培養(yǎng)

　　原代培養(yǎng)是指細(xì)胞從組織中分離并在適當(dāng)條件下增殖，直到它們占據(jù)所有可用基質(zhì)(即達(dá)到匯合)后的培養(yǎng)階段。在這個(gè)階段，必須通過將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到具有新鮮生長培養(yǎng)基的新容器中來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)(即傳代)，以提供更多的繼續(xù)生長的空間。

　　2.細(xì)胞系

　　在第一次繼代培養(yǎng)后，原代培養(yǎng)物被稱為細(xì)胞系或亞克隆。來源于原代培養(yǎng)物的細(xì)胞系具有有限的壽命(即，它們是有限的)，當(dāng)它們傳代時(shí)，具有最高生長能力的細(xì)胞占優(yōu)勢，從而在群體中產(chǎn)生一定程度的基因型和表型一致性。

　　3.細(xì)胞株

　　如果通過克隆或其他方法從培養(yǎng)物中積極選擇細(xì)胞系的亞群，則該細(xì)胞系成為細(xì)胞株。細(xì)胞株通常在親本系開始后獲得額外的遺傳變化。

　　4.有限細(xì)胞系與連續(xù)細(xì)胞系

　　正常細(xì)胞在失去增殖能力之前通常只分裂有限的次數(shù)，這是一種遺傳決定的事件，稱為衰老;這些細(xì)胞系被稱為有限的。然而，一些細(xì)胞系通過一種稱為轉(zhuǎn)化的過程變得不朽，這種過程可以自發(fā)發(fā)生，也可以通過化學(xué)或病毒誘導(dǎo)。當(dāng)一個(gè)有限的細(xì)胞系經(jīng)歷轉(zhuǎn)換并獲得無限分裂的能力時(shí)，它就變成了一個(gè)連續(xù)的細(xì)胞系。

　　連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限的細(xì)胞系注定會(huì)衰老，所有細(xì)胞培養(yǎng)物都容易受到微生物污染，即使是運(yùn)行實(shí)驗(yàn)室也可能出現(xiàn)設(shè)備故障。由于已建立的細(xì)胞系是一種寶貴的資源，其替代品昂貴且耗時(shí)，因此將其冷凍保存以備長期儲(chǔ)存至關(guān)重要。

　　一旦從傳代培養(yǎng)中獲得少量剩余的細(xì)胞，應(yīng)將其作為種子儲(chǔ)備冷凍，并加以保護(hù)，不得供一般實(shí)驗(yàn)室使用。可從冷凍種子儲(chǔ)備中制備和補(bǔ)充工作儲(chǔ)備。如果種子儲(chǔ)備耗盡，然后，冷凍保存的工作儲(chǔ)備可以作為制備新鮮種子儲(chǔ)備的來源，從初始冷凍開始，產(chǎn)生數(shù)量的增加最小。

　　冷凍保存培養(yǎng)細(xì)胞的最佳方法是在液氮中，在培養(yǎng)基中，在二甲基亞砜(DMSO)或甘油等冷凍保護(hù)劑的存在下保存細(xì)胞。低溫保護(hù)劑可以降低介質(zhì)的冰點(diǎn)，也可以降低冷卻速度，從而大大降低冰晶形成的風(fēng)險(xiǎn)，而冰晶形成會(huì)損害細(xì)胞并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

　　DMSO已知有助于有機(jī)分子進(jìn)入組織。處理含有二甲基亞砜的試劑時(shí)，應(yīng)使用適用于此類材料危害的設(shè)備和做法。按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處理試劑。

　　從冷凍工作細(xì)胞儲(chǔ)備中培養(yǎng)細(xì)胞：

　　確定傳代次數(shù)，例如，如果先前的細(xì)胞被冷凍，它們被解凍三次，解凍過程將是第四次傳代。

　　將生長培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基、小牛血清和抗生素)添加到標(biāo)記有細(xì)胞系、傳代數(shù)和日期的T75燒瓶中

　　將燒瓶水平放置在37℃和5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中至少15分鐘。這將使介質(zhì)升溫并達(dá)到其正常pH值(7.0-7.6)

　　在37攝氏度的水浴中輕輕攪拌，使冷凍小瓶與細(xì)胞系解凍。為了降低污染風(fēng)險(xiǎn)，將O形圈和蓋子保持在水位以上(2-5分鐘)。

　　將小瓶放在生物安全柜(BSL-2)中。為避免污染，打開小瓶前，用70%乙醇擦拭。

　　將冷凍的細(xì)胞瓶內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有生長培養(yǎng)基的T75燒瓶中。輕輕混合并搖動(dòng)燒瓶，使細(xì)胞均勻分布在燒瓶表面。

　　在37℃、5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)燒瓶過夜。允許細(xì)胞整夜附著

　　改變?cè)鲩L：

　　將燒瓶在37℃、5%CO2下再培養(yǎng)2-4天，并監(jiān)測直至細(xì)胞生長

　　一旦細(xì)胞達(dá)到約90%的匯合，可以使用T150燒瓶擴(kuò)增細(xì)胞儲(chǔ)備

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